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전세계 아미노산 시장은 증가추세에 있어서 매년 성장율이 5.6%에 이른다. 2016년도 전세계 아미노산 생산량은 800만 톤으로서 총 판매액은 미화 백억 불에 이른다. 현재 아미노산 생산 방법은 미생물 발효에 의해서 생산되는데 화학 합성법이나 효소 가수분해법 3가지가 주를 이루는데, 이 가운데 미생물 발효법이 가장 생산성이 높고 가격경쟁력을 갖고 있어서 85% 이상의 아미노산이 이를 통해 생산되고 있다. 현재 아미노산 생산 균주의 대부분은 아미노산류의 스크리닝에 의해서 얻어지는데 그 과정이 독성이 높고, 아미노산의 종류에 제한이 있어서 스크리닝 방법의 정확성을 높이고 활용 범위를 확대하는 것이 아미노산 발효 생산량을 높이는데 중요한 열쇠가 되고 있다. 이러한 요구에 맞추어어 북경이공대학의 Huo Yi-Xin (霍毅欣) 교수 연구팀은 자연계에 널리 존재하는 ldquo;코돈 선호도 rdquo; 규칙을 이용하여 일종의 유사물질에 의존하지 않는 아미노산 고생산균주의 스크리닝 방법을 개발하였다. ldquo;코돈 최적화 rdquo;방법으로 외래 단백질의 발현을 높이는 것과 달리, 연구팀은 필수 유전자와 색깔단백질 코딩 유전자의 코드치환이라는 흔하지 않은 방식으로 사용하여 단백질 아미노산 함량 요구의 문턱을 높였다. 그리하여 고효율, 신속히 아미노산 고생산균주의 스크리닝을 실현하여 이 방법이 대장균과 C.glutamicum 두 종류의 아미노산 생산에서 흔히 사용하는 두 균주에서 에서 그 타당성을 검증하였다. 이러한 희귀 코돈의 스크리닝 전략을 아미노산 고생산 균주의 스크리닝이나 개조에 사용하는 것은 유사 물질에 기초한 스크리닝이 아닌 새로운 시스템으로 유사물질을 사용하는 경우의 독성, 개선된 균주의 출현이 낮다는 점, 적용할 수 있는 아미노산 종류의 제한이라는 단점을 극복할 수 있다. 이론적으로 어떤 아미노산 고생산균주의 스크리닝에 사용할 수 있고 동시에, 아미노산 고생산의 메커니즘의 발현과 고생산균의 구축에 있어서 새로운 방식을 제공하였다고 평가할 수 있다. 아미노산 하나에 최고 6개의 코돈이 존재하는데, 핵산서열중의 코돈에 출현 빈도가 다르기 때문에 사용빈도가 가장 낮은 코돈은 희귀 코돈이라고 하며 실험을 통해 대장균의 희귀 코돈의 tRNA농도가 마찬가지로 가장 낮다. 세포의 번역과정에서 tRNA와 아미노산이 아실화 반응에 의해 연결되고 아미노산은 정확하게 펩타이드 사슬에 연결되게 된다. 아미노산 총량은 제한이 있기에 이러한 희소 tRNA는 기타 다른 tRNA와 경쟁에서 아미노산을 따내지 못하여 ldquo;빈상태 rdquo;에 처하게 되어 결국 번역 단계에서 희소 코돈 번역 단계에서 속도가 정체되게 된다. 세포 내 아미노산 농도가 크게 증가하고 대부분의 tRNA가 '가득 차있는'상태일 때만 희귀 한 tRNA는 나머지 아미노산을 포획 할 수 있는 기회를 가지게 되고, 드문 코돈 단편의 정상적인 번역을 보장하게 된다. 그렇다면 이러한 상황은 아미노산을 첨가해주거나 세포내의 아미노산 합성을 통해 완화될 수 있을 것인가? 희귀 코돈 번역의 속도는 세포 내 아미노산 농도와 관련이 있는가? 희귀 코드의 수량을 증가시킴으로서 서열의 번역의 난이도를 높이고 고생산균주의 스크리닝이 가능한 것인가? 희귀 코드의 번역 특성에 기초하여 연구원들은 두 개의 항생제 유전자( kanR 와 specR )와 형광 단백질 ( gfp 와 ppg )가운데 다른 아미노산 코드를 대응하는 희귀 코드로 바꾸어서 성장 레벨과 형광 표지가 지시하는 두 가지 스크리닝 시스템을 만들어내었다. Leucine의 경우를 예로 들어, 단백질의 번역 과정은 카나마이신 내성 유전자 kanR의 leucine 코돈을 희귀 형 CTA로 대체 한 후 카나마이신을 함유하는 희석 된 LB 배지에서 수행 하였다. 이 단백질의 번역은 현저하게 저해를 받아서 세포 내에서 충분히 합성되지 못해서 균체의 농도가 현저하게 감소되었다. 외부에서 leucine을 첨가해준 후에 희귀코돈CTA에 대응하는 tRNA가 leucine을 충전하게 되어, 프로모터가 희귀코돈을 가진 항생단백질의 번역을 시작하여 균체 성장이 회복되었다. 이러한 ldquo;억제-회복 rdquo;현상은 아미노산 햠량과 희귀코돈단백질 번역속도에 정비례의 관계가 이따는 것을 증명하며 아미노산 농도의 증가에 의해서 의해 ldquo;역최적화 rdquo;유전자의 발현을 촉진할 수 있다는 것을 보여준 것이라고 할 수 있다. 희귀 코돈과 아미노산 농도의 상관관계를 이용하여 연구진은 대장균과 C.glutamicum균주의 돌연변이 라이브러리를 이용하여 leucine, arginine, serine 아미노산 고생산 균주를 스크리닝해 내었다. Leucine고생산 대장규네서 transcriptome과 genome분석을 통해 돌연변이 균주 세포내에 leucine농도가 높아지고 그 합성과 흡수 경로가 강해지고 외부 배출 능력은 감소했음을 밝혔다. 이외에도, 프로모터의 세기, 플라스미드 카피 수, 희귀코돈의 수를 바꾸어서 이 시스템의 스크리닝 압력을 조절할 수 있다. 연구는 다른 희귀코돈을 바꿈으로써 각 서열번역의 영향 강도가 다르며, 극단의 상황에서는 양분이 충분해도 희귀코돈을 가진 유전자는 정상 번역을 할 수 없고, 이는 희귀코돈이 mRNA안정성의 영향에 있어서 새로운 근거를 제시한 것이라고 할 수 있다. 희귀 코돈에 기초한 완전히 새로운 스크리닝 전략을 아미노산 유사물질 스크리닝 방법이 가진 여러가지 문제를 극복하고 스크리닝 과정에서 한 가지 표지 유전자만 필요로 하며 대상균주의 유전적 배경에는 어떤 변화도 필요하지 않다. 또한 스크리닝 과정에서 독성 물질의 생산이 없고, 이론상 어떤 아미노산 고생산 균주의 스크리닝에 사용할 수 있어 아미노산 발효 산업의 발전에 공헌할 수 있을 것으로 보인다. 본 연구는 《 Nature Communications ,IF=12.353》에 실렸으며 북경이공대학 생명과학대학의 청년 천인과학자인Huo Yi-Xin교수가 교신 저자로 참가하였고, 북경이공대학 생명과학대학 박사과정 정박( 郑 博 ), 박사후과정 마효언( 马晓 焉 )이 공동 1저자로 참가하였다. 실험은 북경이공대학의 소주캠퍼스인 UCLA 선진기술연구원 연합 연구실에서 진행되었으며, 청년천인계획, 국가자연과학기금, 국가중점연구계획, 중국박사후과정 면상기금의 지원으로 이루어졌다. |
